抗酸染色是细菌学中另一种广泛使用的差异染色程序。一些细菌抵抗酸和酒精的脱色，因此它们被称为抗酸生物。酸醇（3%盐酸95%乙醇）是一种非常强烈的脱色剂。这种染色技术将细菌分为两组。（1）抗酸和（2）非抗酸。该程序广泛用于结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌的诊断。某些分枝杆菌和某些诺卡菌属的耐酸牢度特性与其高脂质含量（60%w/w）相关。由于细胞壁的脂质含量高，抗酸细胞的染色渗透性相对较低，因此难以染色。对于这些细菌的染色，使用5%的水性苯酚作为化学增强剂，促进了初级染料的渗透。还使用热量作为物理增强器。一旦这些细胞被染色，就很难用酸和酒精脱色。
在抗酸染色中，使用三种不同的试剂或染色剂。
1.原色（卡波尔紫红色）：
Carbol紫红色是一种酚醛染色剂，可溶于脂质材料，脂质材料构成分枝杆菌细胞壁的主要部分，可穿透和保留红色染色剂。通过施加热量来增加渗透，这驱动卡波尔紫红色通过脂质壁并进入细胞质。应用原染后，所有细胞都显示为红色。
2.脱色剂（酸性醇或20%H2SO4）：
涂抹在脱色前冷却，使蜡质细胞物质变硬。使用脱色剂后，抗酸细胞表现出抗脱色性。与脱色试剂相比，原性染色剂更易溶于细胞蜡。因此，原发性染色被分枝杆菌保留，但对于缺乏细胞蜡的非酸性快速细菌来说，情况并非如此。在脱色过程中很容易去除原色，并且观察到非酸性快速细胞为无色。
3.复染（亚甲蓝或孔雀石绿）：
非抗酸细菌吸收反染剂并呈现蓝色或绿色，而抗酸细胞保留原染色剂的红色。孢子染色技术用于检测携带孢子的细菌和孢子类型。孢子不易被初级染色剂（孔雀石绿）染色。因此，涂片被加热以染色孢子。一旦孢子接受孔雀石绿，它就不能被自来水脱色。营养细胞很容易被自来水脱色并采取复染并呈现红色（Safranin）。
胶囊染色用于检测细胞周围胶囊的存在。它可以通过使用阳性和阴性染色技术来进行。由于胶囊的非离子性质，它对染料的亲和力非常小。在阳性染色剂中，应用结晶紫对细菌细胞进行染色。渗透压差异是由硫酸铜（20%）溶液的应用产生的，这会导致染色剂向细胞外表面扩散。在去除硫酸铜溶液并干燥载玻片时，一些污渍在扩散过程中没有穿过包膜周围。这种染色剂保留在包膜层中，作为浅紫色对深紫色细胞。胶囊也很容易通过阴性染色技术进行证明。当应用染色溶液时，它会染色细胞，并在应用黑素背景时染色，使胶囊无色。
不同的其他染色技术也用于研究细菌的形态。鞭毛染色用于检测鞭毛的存在和排列，细胞质包涵体染色用于鉴定淀粉、糖原、多磷酸盐、羟基丁酸酯和其他物质的细胞内沉积物。